Biologia delle comunicazioni volume 5, numero articolo: 987 (2022) Citare questo articolo
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Lo splicing alternativo è un meccanismo di elaborazione dell'RNA coinvolto nello sviluppo e nella patologia del muscolo scheletrico. Le malattie muscolari mostrano alterazioni di splicing e cambiamenti nella meccanobiologia che ci portano a indagare l'interconnessione tra le forze meccaniche e l'elaborazione dell'RNA. Abbiamo eseguito un sequenziamento profondo dell'RNA dopo aver allungato le cellule muscolari. Innanzitutto, abbiamo scoperto cambiamenti trascrizionali nei geni che codificano per proteine coinvolte nella funzione muscolare e nella trascrizione. In secondo luogo, abbiamo osservato che numerosi geni meccanosensibili facevano parte del percorso MAPK che veniva attivato in risposta allo stretching. In terzo luogo, abbiamo rivelato che lo stiramento delle cellule muscolari scheletriche aumenta la proporzione di esoni a cassetta con giunzione alternativa e la loro inclusione. In quarto luogo, abbiamo dimostrato che le proteine ricche di serina e arginina mostravano cambiamenti trascrizionali più forti rispetto ad altre proteine che legano l'RNA e che la fosforilazione di SRSF4 è meccanosensibile. Identificare SRSF4 come una proteina meccanosensibile legante l'RNA che potrebbe contribuire alla diafonia tra meccanotrasduzione, trascrizione e splicing potrebbe potenzialmente rivelare nuove intuizioni sulle malattie muscolari, in particolare quelle con eziologie sconosciute.
Lo splicing alternativo è un meccanismo di elaborazione dell'RNA che espande la diversità proteica ed è estremamente diffuso negli eucarioti superiori con oltre il 95% dei geni umani sottoposti a splicing alternativo1. Nel muscolo scheletrico, si verificano estese transizioni di splicing alternativo postnatale2 che contribuiscono alla maturazione dell'apparato contrattile3,4,5,6. Il muscolo scheletrico è un tessuto complesso che dipende sia dai meccanismi molecolari che dalle proprietà meccaniche per il suo sviluppo. L'apparato contrattile muscolare è costituito da sarcomeri, tubuli trasversali e costameri, che insieme trasducono forza sia attraverso le cellule muscolari che dal nucleo alla membrana plasmatica in un processo noto come meccanotrasduzione7. È interessante notare che, in varie malattie muscolari, i modelli di splicing alternativo dell'adulto ritornano allo stadio fetale contribuendo alla perdita muscolare, all'atrofia e al fallimento funzionale del muscolo3,4,8,9. Pertanto, le transizioni molecolari nel muscolo scheletrico sono importanti per il corretto sviluppo del tessuto.
Oltre a subire transizioni molecolari durante lo sviluppo, il muscolo scheletrico deve rispondere alle forze meccaniche e generare esplosioni di forza coordinate attraverso la contrazione. Le cellule muscolari sono particolarmente sensibili alla meccanotrasduzione10; la rigidità dell'ambiente circostante controlla l'allungamento e la differenziazione cellulare, che a loro volta sono fondamentali per un'efficiente contrazione muscolare11. Rispetto agli individui sani, le cellule muscolari di coloro che soffrono di distrofia muscolare sono più rigide e si ritiene che ciò impedisca una corretta contrattilità, portando infine all'atrofia muscolare11,12,13.
È stato ampiamente dimostrato che lo misplicing globale o l'errata regolazione dei singoli eventi di splicing alternativo comportano la perdita della corretta funzione muscolare2,3,4,6,14,15. Topi affetti da distrofia muscolare di Duchenne (che disregola lo splicing) presentano alterazioni nelle vie di segnalazione meccanosensibili che indicano che i cambiamenti fisici nel muscolo sono collegati a risposte molecolari16. Ampliando questa idea, i topi anziani affetti da distrofia muscolare mostrano una riduzione dell'affaticamento in risposta a un intervento che include sia la terapia di commutazione della giunzione che l'esercizio17. Questi studi stabiliscono un legame tra malattie muscolari, cattiva regolazione dello splicing e alterazioni meccaniche del muscolo. Tuttavia, non è noto come le forze meccaniche e lo splicing alternativo cooperino per mantenere l’omeostasi muscolare e in che misura contribuiscano all’insorgenza delle malattie muscolari.
90% of them mapping to the mm10 mouse genome (Supplementary Data 1). The high mapping rate indicates appropriate quality of our sequencing data. We first confirmed that several myogenesis markers were not expressed in the myoblast samples and were highly induced in the differentiated cells (Supplementary Fig. 1). We next performed principal component analysis (PCA) to cluster samples based on gene expression for both myoblasts (Fig. 1a) and differentiated cells (Fig. 1b). The non-stretched myoblasts segregated together with two distinct subclusters for the 1 h stretched samples and the 6 h stretched samples (Fig. 1a, dark green and dark blue respectively). The 3 h stretched myoblasts segregated closer to the non-stretched samples (Fig. 1a, dark purple). In the differentiated cells, all the non-stretched samples segregated together and we observed three distinct groups for the different stretching time points demonstrating that varying times of stretching resulted in distinct gene expression changes (Fig. 1b, dark green, dark purple, and dark blue). One of the 1 h stretched samples did not segregate closely with the other replicates but remained more similar to them than to samples at other time points. This sample passed other quality controls and was therefore included with all samples in the analysis described in the results. Post hoc tests excluding this sample were performed and did not change the conclusions of the study./p>1.50 (upregulated, up) or fold change < −1.50 (downregulated, down). e, f. Correlation plot between the gene expression changes (expressed as log2foldchange) as measured by qPCR assays and those observed in the RNA-seq studies in myoblasts and differentiated cells. The qPCR graphs for the individual genes included in the correlation plots are shown in Supplementary Fig. 2 (myoblasts) and Supplementary Fig. 3 (differentiated cells)./p>1.5 for upregulated genes and a fold change <−1.5 for downregulated genes and an adjusted p-value < 0.05. Two of the genes assayed in both myoblasts and differentiated cells were the connective tissue growth factor (Ctgf) and the cysteine-rich angiogenic inducer 61 (Cyr61) which are both well-established mechanosensitive genes26,27,28. Ctgf and Cyr61 mRNAs were upregulated after 1 h of stretching in myoblasts and after 1 h and 3 h of stretching in differentiated cells indicating successful cellular stretching (Supplementary Figs. 2, 3). After 6 h of stretching, Ctgf and Cyr61 mRNAs were not upregulated in either myoblasts or differentiated cells (Supplementary Figs. 2, 3) suggesting that the cells become accustomed to the long mechanical stimulus which has been previously reported28./p> 10. In myoblasts, we observed an increase in the total number of splicing events as the cells were stretched for longer periods of time (Fig. 4a, left). Whereas in differentiated cells, the total number of splicing events increased from 1 h to 3 h and slightly decreased from 3 h to 6 h (Fig. 4a, right)./p> 10 between stretched and non-stretched samples. The ΔPSI was defined as the difference between the PSI in stretched samples and the PSI in the non-stretched controls. PSI percent spliced in./p>44% of splicing events at all time points were cassette exons (Fig. 5b). Second, we found that as cells were stretched, the proportion of cassette exons being alternatively spliced increased over time while the proportion of retained introns decreased (except for the transition from 3 h to 6 h in differentiated cells) (Fig. 5b). We focused the rest of our analysis on cassette exons since these were the most prevalent type of splicing event./p> 10, blue) or more exclusion (ΔPSI < −10, red) of the alternatively spliced region upon stretching. The numbers between parentheses indicate the number of splicing events. The ΔPSI was defined as the difference between the PSI in stretched samples and the PSI in the non-stretched controls. PSI percent spliced in./p> 10 (stretching induces inclusion) increases over stretching time (Supplementary Fig. 8a, left). In differentiated cells, we observed a more drastic trend in the same direction (Supplementary Fig. 8a, right). Since we focused most of our analysis on cassette exons we also determined if stretching induced more skipping or inclusion specifically of cassette exons. In myoblasts, the proportion of cassette exons with ΔPSI <−10 (stretching induces exclusion) increases slightly over stretching time (Fig. 5e, top). In differentiated cells, we observed an opposite trend with longer stretching times inducing more inclusion of cassette exons (Fig. 5e, bottom)./p> 95, r28S:18 S > 2.8 and RNA integrated number (RIN) > 8.4. Kapa mRNA stranded method was used for library preparation. All samples were pooled, and the library was first run on an Illumina MiSeq Nano to verify sequencing quality. After quality verification, the library was run on one flow cell over four lanes on a NovaSeq 6000S4 sequencer in a paired end 2 × 100 cycle run at the High Throughput Sequencing Core at The University of North Carolina at Chapel Hill./p>1.50 for upregulated genes, or fold change <−1.50 for downregulated genes). Significant changes in gene expression for myoblasts are in Supplementary Data 2 and for differentiated cells are in Supplementary Data 3. To determine differential alternative splicing in response to stretching, reads were aligned to the Gencode mm10 genome and Gencode vM20 transcriptome that contained reference chromosomes, scaffolds, assembly patches, and haplotypes. Differential splicing was determined using MISO and datasets were created that contained the MISO summary counts of all samples at each timepoint35. Those datasets were then used to compare the stretched samples to the non-stretched controls at each timepoint. Events were filtered by total read depth ≥15 and either inclusion reads ≥5 or exclusion reads ≥5. After filtering, events were considered alternatively spliced if |ΔPSI| (|PSIstretch–PSIno stretch|) >10 and the Wilcox p-value (stretch versus no stretch) ≤0.05. Significant changes in alternative splicing for myoblasts are in Supplementary Data 4 and those for differentiated cells are in Supplementary Data 5. In the excel files the ΔPSI values are shown in a scale from 0 to 1 (for inclusion) or 0 to −1 (for exclusion)./p>3.0.CO;2-C" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-0177%28199808%29212%3A4%3C495%3A%3AAID-AJA3%3E3.0.CO%3B2-C" aria-label="Article reference 47" data-doi="10.1002/(SICI)1097-0177(199808)212:43.0.CO;2-C"Article CAS PubMed Google Scholar /p>
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